In de groep van Medische Cel Biologie, produceren en werken we
met Humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSCs)
- Stamcellen zijn van enorme waarde voor regeneratieve geneeskunde. Deze cellen vernieuwen zich voor onbepaalde tijd en kunnen differentiëren in bijna elk celtype in het menselijk lichaam. Humane embryonale stamcellen worden al tientallen jaren gebruikt, maar meer recentelijk hebben IPSCs een revolutie teweeggebracht op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Deze geïnduceerde stamcellen bieden veel voordelen: ze brengen minder ethische bezwaren met zich mee en vertonen de genetische achtergrond van de donorpatiënt. IPSCs worden direct gegenereerd in ons lab, met behulp van een integratievrije herprogrammeringsaanpak. Invasieve monsterafname van de patiënt wordt vermeden door te werken met een eenvoudig urinemonster. Geëxfolieerde nierepitheelcellen worden geïsoleerd en geëxpandeerd uit het urinemonster en dienen als uitstekend uitgangsmateriaal voor herprogrammering. De commerciële Sendai Cytotune 2.0 kit (Life Technologies) wordt gebruikt voor maximale efficiëntie en betrouwbaarheid.
- De gegenereerde IPSCs ondergaan een uitgebreide kwaliteitscontrole. We controleren morfologie met behulp van microscopie, de kolonies zijn rond en dicht opeen gepakt, met gladde randen en een transparant lichaam. Pluripotentie wordt bevestigd door kleuring voor specifieke factoren, zoals POU5F1, NANOG en SOX2. Shallow whole genome sequencing (SWGS) zal ons waarschuwen in geval van genomische afwijkingen, zoals deleties of duplicaties. Het differentiatiepotentieel wordt bevestigd door de IPSCs te richten op de drie verschillende kiemlijnen, die met behulp van PCR worden gevalideerd. De pathogene variant van interesse (indien aanwezig) wordt gecontroleerd met behulp van Sanger-sequencing.
- Met de opkomst van CRISPR genome editing kunnen we precieze veranderingen in het genoom aanbrengen. Zo kunnen we ziekteverwekkende varianten in het genoom corrigeren. In ons lab gebruiken we de volgende workflow, waarbij we een gecomplexeerd Cas9 toevoegen, het eiwit dat het DNA knipt met het enkele gids-RNA, dat de doellocatie van belang herkent. Naast dit RNP-complex voegen we een enkelstrengs oligodeoxynucleotide-reparatiesjabloon toe door middel van nucleofectie. Wanneer Cas9 een dubbele strengbreuk introduceert, zal de cel proberen deze breuk te repareren door een proces dat NHEJ (niet-homologe eindverbinding) wordt genoemd. Dit proces is echter gevoelig voor fouten, waardoor andere mutaties kunnen worden geïntroduceerd. Door een reparatiesjabloon te leveren, gebruikt de cel een alternatieve, preciezere reparatiemethode: homologie gerichte reparatie. Na herstel worden de cellen één voor één gesorteerd in een nieuwe put, om monoklonaliteit te garanderen. Reparatie van de beoogde pathogene variant wordt geëvalueerd, waarna de succesvol gecorrigeerde klonen verder worden uitgebreid en onderworpen aan dezelfde karakterisering als hierboven beschreven. Deze gegenereerde lijnen dienen als isogene controles, met een identieke genetische achtergrond (afgezien van de gecorrigeerde pathogene variant) als de zieke iPSC-lijn.